南方菜豆花叶病毒ELISA试剂盒免费专业检测说明书
一、南方菜豆花叶病毒ELISA试剂盒免费专业检测说明书是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
二、ELISA实验前的准备
1仔细阅读说明书
2确定试剂盒在有效期内
3按说明书确定所有试剂齐全(数量、体积)
4标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备(贮存)，尽量分装做备份。短期内无法实验者，注意低温保存
5准备好所有实验额外所需物品，如试管、吸头、移液器、离心机等
6根据检测标本数量确定所需试剂的量
7按说明书将所用试剂平衡至室温，配制所需试剂
三、ELISA试剂盒组成
[96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整）
中文名称
英文名称
规格
保存条件
ELISA酶标板（可拆卸）
MicroELISAPlate(Dismountable)
8×12 / 8×6
4°C/-20°C
冻干标准品
Reference Standard
2/1支
4C/-20°C
标准品&样品稀释液
Reference Standard & Sample Diluent
1瓶20mL/12mL
4°C
浓缩生物素化抗体
Concentrated Biotinylated Detection Ab
1支120μL/70μL
4째C/-20째C
生物素化抗体稀释液
BiotinylatedDetection Ab Diluent
1瓶10mL/6mL
4°C
浓缩HRP酶结合物
ConcentratedHRPConjugate
1支120μL/70μL
4°C(避光)
酶结合物稀释液
HRP Conjugate Diluent
1瓶10mL/6mL
4°C
浓缩洗涤液（25×）
Concentrated Wash Buffer (25×)
1瓶30mL/16mL
4°C
底物溶液（TMB）
Substrate Reagent
1瓶10mL/6mL
4°C(避光)
反应终止液
Stop Solution
1瓶10mL/mL
4°C
封板覆膜
Plate Sealer
5/3张
产品说明书
Product Description
1份
质检报告
Certificate of Analysis
1份
四、ELISA试剂盒检测范围和保存条件及有效期
1.试剂盒保存：2-8℃;
2．有效期：6个月。
五、南方菜豆花叶病毒ELISA试剂盒免费专业检测说明书注意事项
1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2）包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
六、南方菜豆花叶病毒ELISA试剂盒免费专业检测说明书操作步骤
1.包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):
将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度(一般所需抗原包被量为每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体.(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)
2.封闭酶标反应孔:
5%小牛血清置37℃封闭40min.封闭时将封闭液加满各反应孔,并去除各孔中的气泡,封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.
洗涤方法:吸干孔内反应液,将洗涤液注满板孔,放置2min略作摇动,吸干孔内液,倾去液体后在吸水纸上拍干洗涤次数3次
3.加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):
检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl.
将稀释好的样品加入酶标反应孔中,每样品至少加双孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.
4.加入酶标抗体:
酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行. 37℃,30-60min之间.短于30min往往结果不稳定.每孔加100μl.洗涤同前。
5.加入底物液(现用现配):
首选TMB-过氧化氢尿素溶液,OPD-过氧化氢底物液系统次之.
底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分钟,加入终止液显色.
6.终止反应:
每孔加入终止液50μl终止反应,于20min内测定实验结果.
7.结果判断:
OPD显色后采用492nm波长,TMB反应产物检测需要450nm波长.检测时一定要首先进行空白孔系统调零.用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示,当P/N大于2时作为抗体的效价 (数值的大小依具体检测要求而定)
